Protocolo de isolamento do vírus da dengue na linhagem C6 / 36, montado no Laboratório de Doenças Moleculares Infecciosas do Departamento de Bioquímica e Medicina Molecular da Faculdade de Medicina da UANL. Monterrey, N.L.
PRINCÍPIO: O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos
procedimentos do laboratório de Microbiologia.
UTILIDADE: Nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e pode ser utilizado para
análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à
exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras.
Uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente
neste ágar, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da
crioconservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC).
Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos.
FÓRMULA / PRODUTO
Produto: Nutriente Ágar
Fórmula: Extrato de carne 3 g
ـ Peptona 5 g
ـ Ágar ágar 15 g
ـ Água destilada 1000 ml
ـ pH: 6,8 +/- 0,2
PROCEDIMENTOS: Pesar e hidratar os componentes; Fundir; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície
em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).
CONTROLE DE QUALIDADE: Crescimento bom a excelente:
Escherichia coli ATCC 25922
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.
INOCULAÇÃO: Estriar a superfície inclinada do meio; Incubar.
INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: branco opalescente .Positivo: Crescimento na superfície do ágar . Negativo: Ausência de crescimento.
RECOMENDAÇÕES: Usar tubos com tampa de rosca para evitar ressecamento do ágar. Repicar as cepas conservadas a cada 3 meses. Conservar as cepas após o crescimento no meio em temperatura ambiente. Por ser um meio nutritivo, a ausência de crescimento não deverá ocorrer.
ÁGAR CHOCOLATE
PRINCÍPIO: Meio de Ágar Chocolate é amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes,
embora cresçam neste meio quase todos os tipos de microrganismos. À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz
com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o
crescimento dos microrganismos exigentes.
Observação: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os
suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à
aproximadamente 50ºC.
UTILIDADE: Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella
catarrhalis e Moraxella spp.
FÓRMULA / PRODUTO: Meios comerciais: BHI Ágar *, Columbia Ágar Base, Blood Ágar Base, Mueller Hinton Ágar. Sangue de cavalo, carneiro ou coelho desfibrinado. Recomenda-se o uso da base de BHI Ágar, por apresentar melhor crescimento das cepas
exigentes, principalmente cepas de Haemophilus spp.
PROCEDIMENTOS: Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base à temperatura de aproximadamente 80ºC; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 ml de base; Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias e o meio apresentar uma cor castanho escuro
(chocolate); Distribuir em placas de Petri de 90 mm de diâmetro.
CONTROLE DE QUALIDADE: Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC 10211.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.
INOCULAÇÃO: Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento; Incubar a 35ºC por 24 horas.
INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp,
Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.
RECOMENDAÇÕES: Lembrar que é um meio rico e crescem vários tipos de microrganismos.Fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas e corar pela técnica de Gram, para confirmar se
trata-se ou não de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram
negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram negativos delicados e pleomérficos). Não usar sangue de cavalo vencido. Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser
abundante. Sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de
identificação, para não correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.
ÁGAR THAYER-MARTIN CHOCOLATE
PRINCÍPIO: É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria
gonorrhoeae e Neisseria meningitidis , pois contém em sua fórmula antibióticos que inibem o
crescimento de Neisserias saprófitas e outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios
contaminados.
UTILIDADE: Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do
material de investigação.
FÓRMULA / PRODUTO: Meio comercial: Thayer-Martin Ágar Base. Sangue desfibrinado de carneiro. Suplemento I: mistura de inibidores (antibióticos). Suplemento II: mistura de fatores de crescimento.
PROCEDIMENTOS: Dissolver os suplementos liofilizados conforme instruções do fabricante (normalmente em água
destilada estéril que já acompanha o kit) e reservar; Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante (normalmente prepara-se 200 ml de
base para cada frasco de suplementos I e II ); Esterilizar em autoclave; Esfriar a base a 80ºC; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias e o meio apresentar uma cor castanho escura
(chocolate); Deixar resfriar a base a 50ºC; Adicionar assepticamente à base resfriada os suplementos previamente dissolvidos; Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm ou 4 ml por tubos e inclinar para a superfície ficar em
forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).
ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
PRINCÍPIO: Ágar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem
microrganismos Gram positivos. A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é lactose positiva
(bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho
neutro resultando na formação de colônias de cor rosa), e bactérias que não fermentam a lactose
formam colônias transparentes. Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de
colônias de cor negra no centro.
UTILIDADE: Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água.
FÓRMULA / PRODUTO: Meio comercial: Ágar SS.
PROCEDIMENTOS: Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer o meio até fundir o ágar; Não autoclavar;
ƒ Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis; Deixar em temperatura ambiente até resfriar; Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C.
INOCULAÇÃO: Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: vermelho alaranjado. Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella. Colônias incolores: suspeita de Shigella spp. Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores. As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Conservar embalado de 4 a 8°C por 3 meses.
RECOMENDAÇÕES: Ausência de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. Não autoclavar, pois a alta temperatura degrada o açúcar contido no meio.
CALDO SELENITO
PRINCÍPIO : Tem propriedades que inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos.
UTILIDADE: Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de
fezes, urina e alimentos.
FÓRMULA / PRODUTO : Meio comercial: Selenito , Novobiocina
PROCEDIMENTOS: Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer até levantar fervura, homogeneizando de vez em quando; Não autoclavar; Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o véu de
Proteus spp.); Distribuir 7 ml em tubos estéreis de 15x150 mm com tampa de rosca.
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento: Preparar uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium ATCC 14028
na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspensão na placa de SS; Incubar a placa a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.
Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium.
Negativo: não á crescimento de Escherichia coli.
INOCULAÇÃO : Inocular 3 a 4 alçadas da amostra de fezes no meio de cultura; Incubar a 35±1°C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: vermelho tijolo. Após incubação, semear com o auxílio de uma alça bacteriológica em meios seletivos e
enriquecidos (SS, Mac Conkey, XLD, Hectoen).
CALDO TETRATIONATO
PRINCÍPIO: Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adição
da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de espécies fecais.
UTILIDADE: Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo Tetrationato. Solução de Iodo para tetrationato: para ser adicionado no caldo antes de semeada a amostra
de fezes.
Iodo metálico 6,0 g
ـ Iodeto de potássio 5,0 g
ـ Água destilada 20,0 ml
PROCEDIMENTOS
Caldo tetrationato. Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante; Aquecer até ferver; Distribuir 10 ml em tubos estéreis com tampa de rosca; Não autoclavar.
Solução de iodeto de potássio. Macerar o iodeto de potássio e o iodo em um graal; Adicionar água aos poucos até dissolver completamente; Colocar em frasco âmbar.
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento: Preparar uma suspensão de Salmonella typhimurium ATCC 14028 e uma cepa de Escherichia coli
ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspensão em uma placa de SS; Se houver crescimento de Salmonella e inibição de Escherichia coli, liberar o lote para uso.
INOCULAÇÃO: Adicionar 0,2 ml da solução de iodo no tubo; Inocular 1a 3 g da amostra de fezes e homogeneizar vigorosamente; Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: límpido com precipitado branco. O crescimento é indicado pela turbidez do meio. Após incubação, semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou Mac Conkey.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE : Tetrationato: Conservar de 4 a 8°C por até 4 meses. Solução de iodo: Conservar em frasco âmbar a temperatura ambiente por até 12 meses.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Neisseria gonorrhoeae 43069 e Neisseria meningitidis 13090.
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.
INOCULAÇAO: Usar a técnica de semeadura por esgotamento; Incubar em CO2 e umidade (jarra com vela acesa e um chumaço de algodão embebido em água); Incubação por 48 horas.
INTERPRETAÇÃO : Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colônias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria
meningitidis. Fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas e corar pela técnica de Gram, para confirmar se
trata-se ou não de Neisseria (diplococos Gram negativos reniformes). Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificação com testes de oxidase e provas de
fermentação.
RECOMENDAÇÕES: Antes de semear o material biológico aquecer o meio de cultura em estufa à 35ºC, pois
temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisserias; Não usar meio, suplementos e sangue vencidos; Se não for incubado em CO2 e não houver crescimento, pode ser um resultado falso - negativo,
pois as Neisserias necessitam de atmosfera com o CO2 para o crescimento; Se não houver crescimento, incubar até 5 dias.
CALDO TIOGLICOLATO COM INDICADOR
PRINCÍPIO: O meio de Tioglicolato dá suporte para o crescimento de vários microrganismos. O potencial de
oxidação e redução baixo do meio neutraliza efeitos antibacterianos das espécies preservadas com
mercúrio. A resazurina e o azul de metileno são indicadores da posição de oxidação de aeróbios e a dextrose
incluída na fórmula é para os microrganismos que tem crescimento vigoroso na presença do
carboidrato.
UTILIDADE :Usado para o cultivo de microrganismos aeróbios, microaerófilos e anaeróbios. Usado para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais.
FÓRMULA / PRODUTO: Meio comercial: Tioglicolato caldo com indicador
PROCEDIMENTOS: Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer em bico de Bunsen, até dissolver completamente; Distribuir 5 ml por tubo;Esterilizar em autoclave.pH: 7,2 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE: Crescimento bom a excelente: Bacillus subtilis ATCC 6633, Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE :Temperatura ambiente: 3 meses. Entre 4 a 8ºC: 6 meses.
INOCULAÇÃO:Com auxílio da alça bacteriológica, inocular o material biológico introduzindo a alça até a metade
do tubo; Retirar a alça sem agitar o tubo; Incubar à 35 =/- 1ºC por 24 horas.
INTERPRETAÇÃO : Cor original: amarelo claro. Presença de crescimento: turvação do meio. Ausência de crescimento: meio permanece inalterado. Crescimento de microrganismos anaeróbios: crescimento na profundidade do meio. Crescimento de microrganismos aeróbios: crescimento na superfície do meio.
RECOMENDAÇÕES:Não usar o meio quando estiver com cor rosa ou esverdeado na superfície, pois indica a presença
de oxigênio no meio. Recomenda-se o uso do meio recém preparado, porém, se não houver a presença de oxigênio,
pode-se usar um período maior. Não usar meios que estejam turvos. Não utilizar o meio quando o indicador atingir a metade do volume do meio.
CALDO TIOGLICOLATO SEM INDICADOR
PRINCÍPIO: As substâncias redutoras tioglicolato, cisteína e sulfito de sódio produzem uma anaerobiose
suficiente para microrganismos anaeróbios exigentes.
UTILIDADE
ƒ Usado para o cultivo de microrganismos anaeróbios.
FÓRMULA / PRODUTO: Meio comercial: Tioglicolato caldo sem indicador.
PROCEDIMENTOS: Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer em bico de Bunsen, até dissolver completamente; Distribuir 5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave. pH: 7,2 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE: Crescimento bom a excelente: Clostridium perfringens ATCC 10543.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Temperatura ambiente: 18 meses.
INOCULAÇÃO: Com auxílio da alça bacteriológica, inocular o material biológico introduzindo a alça até o fundo do
tubo; Retirar a alça sem agitar o tubo; Incubar à 35 =/- 1ºC em jarra com gerador de anaerobiose durante 48 horas.
INTERPRETAÇÃO:Cor original: amarelo claro. Presença de crescimento: turvação do meio. Ausência de crescimento: meio permanece inalterado.
RECOMENDAÇÕES: Não usar meios que estejam turvos. Se necessário, incubar um período superior à 48 horas.
ÁGAR MAC CONKEY
PRINCÍPIO: O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos
e estafilococos. A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios, por isso
não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS.
UTILIDADE:Isolar bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou
não da lactose.
FÓRMULA /PRODUTO: Meio comercial: Ágar MacConkey.
PROCEDIMENTOS:Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação até fundir o ágar completamente;
ƒ Esterilizar em autoclave; Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis; Deixar em temperatura ambiente até resfriar; Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C.
CONTROLE DE QUALIDADE:Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (não fermentador de lactose). Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose). Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
INOCULAÇÃO: Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: rosa avermelhado. Crescimento de bacilos Gram negativos. Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose. Colônias incolores: não fermentadoras de lactose. Não há crescimento de cocos Gram positivos.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Conservar as placas embaladas de 4 a 8°C por até 3 meses.
ÁGAR SANGUE
PRINCÍPIO: O meio de Ágar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece ótimas condições de
crescimento a maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a
formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e
Staphylococcus spp.
UTILIDADE :Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos. Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.).
FÓRMULA / PRODUTO : Meio comercial: Blood Ágar Base, Columbia Ágar Base, BHI Ágar, Mueller Hinton Ágar; Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho:
ـ 5 ml para cada 100 ml de meio base.
ـ pH: 6,8 +/- 0,2
PROCEDIMENTOS :Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base à +/- 50ºC; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm de diâmetro.
CONTROLE DE QUALIDADE: Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC
25923. Hemólise alfa hemolítica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC
6305. Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.
INTERPRETAÇÃO:Cor original do meio: vermelho. Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias semeadas (lise total dos
eritrócitos). Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos
eritrócitos). Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem
íntegros).
RECOMENDAÇÕES :Não usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura,
dificultando o estudo de hemólise; Não usar sangue humano, pois alguns microrganismos não apresentam hemólise; Não adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemácias rompem-se, dificultando o
estude de hemólise;
Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser abundante,
sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de identificação, para não
correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.
ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
PRINCÍPIO :Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A
deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus.
UTILIDADE :Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.
FÓRMULA / PRODUTO : Meio comercial: Ágar Cled.
PROCEDIMENTOS : Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar à +/- 50°C e distribuir de 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis; Deixar em temperatura ambiente até resfriar.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo:
ـ Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colônias
médias ou grandes amareladas, após 48 horas de incubação.
ـ Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colônias azuis
translúcidas.
Negativo: ausência de crescimento
INOCULAÇÃO:Verificar técnica de semeadura quantitativa.
INTERPRETAÇÃO:Cor original do meio: azul claro. Colônias lactose positiva: cor amarela. Colônias lactose negativa: cor azul.
Características de crescimento:
Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de
1,25 mm de diâmetro, as não fermentadoras de lactose colônias azuis.
Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo a branco azulado .
Espécies de Proteus: colônias azul translúcidas, geralmente menor que E.coli.
Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul.
Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de diâmetro.
Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de diâmetro.
Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelo palha e brancas .
Corynebacterium: colônias pequenas e cinza .
Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa .
Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e periferia rugosa .
CONSERVAÇÃO E VALIDADE : Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.
RECOMENDAÇÕES :Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo,
podendo assim verificar se o microrganismo é lactose negativa ou positiva; Espécies de Shigella não crescem em meios deficientes em eletrólitos.
CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
PRINCÍPIO :É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose. A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. A dextose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação.
UTILIDADE : Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não
fermentadores, leveduras e fungos. Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos,
para realização de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C
e para teste de motilidade em lâmina.
FÓRMULA / PRODUTO : Meio comercial: Caldo BHI (infusão de cérebro e coração).
PROCEDIMENTOS:Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE :Positivo: Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 e Candida albicans ATCC 10231. Negativo: meio sem inocular.
INOCULAÇÃO :Com o auxílio de uma alça ou fio bacteriológico, inocular a colônia ou o material a ser testado -
realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas; Incubar a 35°C ±2 por 24 a 48 horas; Para isolamento de fungos incubar por até 5 dias.
INTERPRETAÇÃO:Cor original do meio: amarelo claro, límpido. Positivo: presença de turvação = crescimento bacteriano. Negativo: ausência de turvação.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE :Conservar de 4 a 10°C por 6 meses.
RECOMENDAÇÕES : Para cultivo de anaeróbios, acrescentar 0,1% de ágar. Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos é necessário adição de suplementos a base
de L-cisteína, NAD (fator V) e hemina (fator X).
LÖWENSTEIN JENSEN
PRINCÍPIO :A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das
micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é positivo para
Mycobacterium tuberculosis).
UTILIDADE: Isolamento primário das micobactérias.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou Löwenstein Medium Base
Ovos de galinha frescos
Meio base - fórmula:
Fosfato monopotássico 1,2 g
Sulfato de magnésio 0,12 g
Citrato de magnésio 0,3 g
L-asparagina 1,8 g
Fécula de batata 15,0 g
Glicerol 6,0 ml
Ovos totais 500 ml
Solução de Verde de malaquita a 2% 10 ml
Solução de Verde de malaquita à 2% - Fórmula:
Verde de malaquita 2 g
Água destilada 100 ml
PROCEDIMENTOS
Preparação dos ovos:
Escovar os ovos, um a um, com escova de cerdas macias; Deixar os ovos submersos em água e detergente comum, durante 30 minutos; Enxaguar com água corrente cuidadosamente um a um; Deixar os ovos submersos em álcool etílico a 70% durante 30 minutos; Retirar os ovos cuidadosamente e secar com pano estéril; Reservar os ovos.
Solução de Verde de malaquita a 2%:
Pesar o verde de malaquita e adicionar a água; Homogeneizar bem até dissolver o corante; Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos; Reservar a solução.
Meio comercial:
Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Adicionar o glicerol e aquecer o meio, agitando constantemente até ferver; Esterilizar em autoclave; Resfriar a base à 45 - 50ºC; Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de béquer estéril e transferir, um a um, para
uma proveta estéril de 500 ml; Completar a proveta com ovos até completar 500 ml; Transferir os ovos para um copo de liqüidificador estéril - se não tiver liqüidificador próprio para
laboratório, transferir os ovos para um balão de 1000 ml contendo pérolas de vidro de tamanho
médio, ambos estéreis; Homogeneizar os ovos; Passar os ovos para o balão que contém a base fria, filtrando em funil e gaze estéril; Adicionar o verde de malaquita; Homogeneizar bem; Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfície estourarem; Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estéril; Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfície em forma de bico de flauta (ângulo de
45º) durante 50 minutos a 85ºC - se não tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de
areia à 85ºC colocado em estufa de esterilização, também por 50 minutos, tendo o cuidado de
verificar a temperatura constantemente.
Meio não comercial:
Diluir a L-asparagina em pouca água e dissolver aquecendo lentamente no bico de Bunsen; Acrescentar os demais componentes, exceto os ovos e o verde de malaquita; Esterilizar em autoclave; Seguir os passos 4 ao 14 listados acima.
CONTROLE DE QUALIDADE
Esterilização: colocar todos os tubos em estufa;
Crescimento bom a excelente:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618
Mycobacterium avium ATCC 25291
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
Conservar entre 4 a 8ºC por 3 meses.
INOCULAÇÃO
Para materiais biológicos de sítios contaminados, fazer descontaminação prévia pelas técnicas
desejadas (Petroff, NALC, Lauril sulfato de sódio, Corper & Stoner modificado); Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfície do meio; Manter os tubos inclinados com a tampa semi aberta até secar bem o inóculo; Depois de seco o inóculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias à 35ºC; Semanalmente, abrir as tampas próximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a
presença ou não de crescimento.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: verde claro
Positivo: Crescimento de colônias amarelas
Negativo: ausência de crescimento.
RECOMENDAÇÕES
Como é um meio rico em proteínas, bactérias proteolíticas contaminam o meio, liqüefazendo-o,
para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubação para tirar as culturas que possam
ter contaminado; Não usar ovos velhos; Não quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais; Manter sempre mais que um béquer estéril para o caso de haver algum ovo estragado; Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias
desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo
Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.
MEIO BIFÁSICO: LÖWENSTEIN E MIDDLEBROOK
PRINCÍPIO :O meio é constituído de duas fases, uma sólida que é o meio de Löwenstein Jensen e uma líquida,
que é o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessários para o desenvolvimento das
micobactérias isoladas de materiais nobres.
UTILIDADE: Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactérias do sangue e de materiais paucibacilares,
como líquor, líquido pleural, biópsias, entre outros.
FÓRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou Löwenstein Medium Base
Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth
Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento).
Ovos de galinha frescos
PROCEDIMENTOS:Meio de Löwenstein Jensen: procedimento igual ao já descrito, distribuindo 12 ml do meio em
frascos estéreis com capacidade para 100 ml (usar tampão de algodão e depois do meio pronto -
parte sólida e líquida, substituir por tampa de borracha e lacre de alumínio) e coagulando os
frascos bem inclinados.
Meio Middlebrook 7H-9 broth:
Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante;
ـ Adicionar o glicerol, conforme instruções do fabricante;
ـ Esterilizar em autoclave;
ـ Resfriar a base à - 50ºC;
ـ Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instruções do fabricante;
ـ Homogeneizar bem;
ـ Distribuir 15 ml em cada frasco de Löwenstein Jensen inclinado;
ـ Fazer o controle de qualidade de esterilidade;
ـ Lacrar os frascos com tampa de borracha (previamente submersas em álcool etílico 70%
durante 30 minutos) e lacre de alumínio.
ـ pH: 6,6 +/- 0,2 .
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE: Conservar os frascos embalados de 4 a 8°C por até 3 meses.
INOCULAÇÃO: Por serem materiais estéreis, não é necessário a descontaminação; Colher assepticamente 5 ml de sangue e inocular no frasco ; Se for outro material, inocular até 5 ml de material; Incubar durante 60 dias à 35º /- 0,2; Banhar o meio sólido semanalmente.
INTERPRETAÇÃO:Cor original do meio: parte sólida: verde clara, parte líquida: âmbar claro. Positivo: turvação do meio líquido e crescimento de colônias amarelas no meio sólido. Negativo: ausência de turvação e crescimento nos meios líquido e sólido.
RECOMENDAÇÕES:Não usar frascos com meio líquido turvo; Volumes de inóculos inferires a 2,5 ml podem resultar em culturas falso - negativas; Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias
desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo
Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.
ÁGAR MYCOSEL
PRINCÍPIO: A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatófitos o cloranfenicol
inibe o crescimento de bactérias e alguns fungos filamentosos.
UTILIDADE: Isolamento de fungos patogênicos, principalmente dermatófitos, a partir de material de
investigação contaminado.
FÓRMULA / PRODUTO: Meio comercial: Mycosel Ágar, Mycobiotic Ágar ou Ágar seletivo para fungos patogênicos.
PROCEDIMENTOS:Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de
45º). pH: 6,9 +/- 0,1.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE:Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.
INOCULAÇÃO:Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: estriar na superfície inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro a 37ºC; Observar diariamente a presença ou não de crescimento; Incubar 40 dias.
INTERPRETAÇÃO:Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAÇÕES :A ausência de crescimento não indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns fungos
podem ter o crescimento inibido neste meio. Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o
meio contido em placas.
ÁGAR SABOURAUD
PRINCÍPIO :Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leve duriformes e
filamentosos.
UTILIDADE: Cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados
a infecções superficiais.Caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante).
PROCEDIMENTOS:Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de
45º). pH: 5,6 +/- 0,1 .
CONTROLE DE QUALIDADE:Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE:Conservar embalado de 4 a 8°C por até 6 meses.
INOCULAÇÃO: Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: semear na superfície inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro à 37ºC; Observar diariamente a presença ou não de crescimento; Incubar 40 dias.
INTERPRETAÇÃO :Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAÇÕES :Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o
meio contido em placas. Não usar meios vencidos e/ou ressecados. Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI ágar.
